来了，来了，他来了！检测技术的又一法宝——超敏一步巢式Taqman qPCR

2020-12-09

巢式PCR具有很高的灵敏度和特异性，但传统的巢式PCR采用两对引物，通过两轮PCR，进行目标产物的扩增。这种操作的不便性，使得其高灵敏度的特性难以应用到快速检测和临床诊断中。在单管巢式PCR的扩增中，由于内侧引物会阻碍外侧引物的扩增，因此标准的Taq DNA聚合酶不能在单管巢式PCR的扩增中，发挥其高灵敏度的特性。采用耐高温、且具有链置换活性的聚合酶，可保证在单管反应中，内外两侧引物同时扩增，巢式PCR才能达到真正意义上的高灵敏度。一步法巢式PCR（One-Step Nested PCR）技术最早报道于2013年，虽然其拥有高灵敏度的检测特性，但始终未能在核酸检测领域获得广泛应用。其主要原因是SD聚合酶的链置换活性过于强烈，而导致外切酶活性作用的机会太弱，导致高信噪比的TaqMan探针无法应用于One-Step Nested PCR。因此，One-Step Nested PCR的荧光探针检测只能依靠特异性和信噪比欠佳的发卡FRET探针。          HaiGene凭借在分子工具酶改造工作中积累的的丰富经验，开发出具有探针切割活性的SD 2.0 DNA Polymerase和SD 3.0 DNA/RNA Polymerase，结合独有的P-Bond锚定探针技术，将高信噪比的TaqMan探针应用到One-Step Nested PCR上，建立起了TaqMan One-Step Nested qPCR方法。运用TaqMan One-Step Nested PCR方法检测DNA或RNA分子，在检测灵敏度和扩增速度方面，都是传统TaqMan PCR法难以企及的。因此，TaqMan One-Step Nested PCR技术将是未来基因检测市场争夺战中的最有利武器之一。

一、One-Step Nested PCR 高灵敏度机理

在标准PCR过程中，使用上游和下游两条引物对靶基因进行热循环扩增，每经过一个循环的扩增，产物最多变为2倍。而在One-Step Nested PCR(或称为PCDR法，Polymerase Chain Displacement Reaction)的扩增中由于使用两条上游引物和两条下游引物，因此在每次热循环过程中，产物增加近4倍，在经过30-40次循环后，核酸产物将会高于PCR法成千上万倍，并且所需的循环数更少。在核酸检测的实验中，One-Step Nested PCR法比标准PCR法灵敏度要高10-100倍，并且更容易开发出高灵敏的检测试剂盒。

二、TaqMan One-Step Nested qPCR荧光法核酸检测技术

TaqMan One-Step Nested qPCR技术是在PCDR的基础上，HaiGene研发团队利用具有探针切割活性的SD2.0或SD3.0 DNA/RNA聚合酶，结合独特的P-Bond探针锚定技术开发的一项新的核酸检测技术。该技术较目前核酸检测工作中常用的Taqman qPCR技术，在灵敏度和扩增速度上，具有极大的优势，因此该技术在目前和未来的核酸检测领域具有极大的推广和应用价值。

TaqMan PCR和TaqMan One-Step Nested PCR的性能对比   TaqMan PCR TaqMan One-Step Nested PCR 扩增引物数 两条 四条或六条 探针 双标荧光探针 双标P-Bond荧光探针 热循环倍增数 <2 >2 扩增条件 热变性循环 热变性循环 检测设备 标准定量PCR仪 标准定量PCR仪 数据判读方式 扩增曲线或Ct值 扩增曲线或Ct值 对模板变异敏感度 较敏感 不敏感 5 copy灵敏度 开发难度大，判读困难 开发容易，判读容易 5 copy Ct值 通常>34 通常<28 DNA扩增用酶 Taq SD 2.0 RNA扩增用酶 Taq+MLV、TTx、mTTx、Z05 SD 3.0

三、TaqMan One-Step Nested qPCR荧光法核酸检测技术应用策略

在TaqMan One-Step Nested PCR的实验中，采用4条扩增引物的情况下，检测灵敏度和扩增速度较传统TaqMan PCR法会大幅提高。同时，由于采用了4条扩增引物，当在检测变异度较高的RNA病毒时，突变对扩增引物的影响显著降低，从而避免了漏检的可能性。当再增加一条检测探针时，对突变的敏感度进一步降低，此时已经与TaqMan PCR的双重检测防止漏检的设计完全相同，但One-Step Nested PCR法检测灵敏度更高。为了进一步提高检测灵敏度和扩增速度，可以再增加一对扩增引物，采用6引物进行扩增。

图：TaqMan One-Step Nested PCR引物和探针设计原理

四、TaqMan One-Step Nested qPCR的引物和探针设计原则

表 TaqMan PCR和TaqMan One-Step Nested PCR的引物设计参数对比   TaqMan PCR TaqMan One-Step Nested PCR 扩增引物长度 18-26bp，条件完全相同 扩增引物TM值 55-60℃，条件完全相同（GC含量40-60%最佳 探针长度 20-35bp 20-28bp 探针TM值 一般68℃（>引物10℃） 一般63℃（>引物3-5℃） 扩增片段大小 <200bp <300bp（外侧）     <150bp（内侧） 探针位置 与引物3’端间隔2-6bp 与引物3’端间隔4-20bp

五、TaqMan One-Step Nested PCR的扩增性能展示

1.以非洲猪瘟DNA病毒核酸检测为例，进行TaqMan One-Step Nested PCR与TaqMan PCR两种方法性能的比较。

图4A：传统的TaqMan PCR法对10copy以下模板检测困难， 通常Ct>35，不易判读。   图4B：TaqMan One-Step Nested PCR法5copy的 DNA模板Ct<26，单copy分子Ct<30. 结果易于判读。

2.以2019-CoV RNA病毒核酸检测为例，应用TaqMan One-Step Nested PCR进行检测。

图5A:针对2019-CoV的N基因使用的引物、探针策略图示

图5B：2019-CoV的N基因靶标区段1（FAM通道）灵敏度测试   图5C：2019-CoV的N基因靶标区段2（HEX通道）灵敏度测试

3.TaqMan One-Step Nested PCR用于SNP或变异毒株的分型检测。

图6A:针对2019-CoV的S基因的D614G突变使用的引物、探针策略图示

图6B：2019-CoV病毒 D614G分型结果   图6C：2019-CoV病毒D614（野生型） 灵敏度测试   图6D：2019-CoV病毒G614（突变型） 灵敏度测试

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