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LAMP相关产品

环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)是一种新型的核酸扩增技术,基本原理是采用4/6条特异引物和具有链置换功能的DNA聚合酶(如Bst DNA聚合酶),在65℃恒温扩增核酸,使链置换DNA 的合成不停地自我循环;反应的过程主要分为循环扩增反应起始物的形成和循环扩增反应。LAMP 检测体系中基因的扩增效率极高,可在 30~60min 扩增 109~1010 倍,同时反应过程中,从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的 Mg2+结合,产生副产物焦磷酸镁--乳白色沉淀,便于对反应结果的观测,使扩增和检测一步就可以完成,大大提高检测效率。目前,该技术已经应用于人类和动物病原体的快速检测和疫病诊断,基于此技术的广泛应用和助力LAMP技术更好的应用于实践的宗旨,我公司提供多种恒温扩增DN A聚合酶和LAMP引物设计服务,主要产品如下:
货号 名称 用途
A3801 Bst 2.0 DNA 聚合酶 DNA LAMP
A3901 Bst 3.0 RNA/DNA聚合酶 RNA/DNA LAMP
A3805 Bst 4.0 RNA/DNA聚合酶 RNA/DNA LAMP
A3808 LAMP TaqMan扩增试剂盒 LAMP TaqMan探针法扩增反应
A3802 LAMP-HNB变色扩增试剂盒 LAMP羟基萘酚蓝变色反应
A3803 LAMP浊度扩增试剂盒 LAMP扩增通过浊度观察
A4401 LAMP引物 LAMP扩增
A3806 热蜡冻干DNA/RNA LAMP HNB 试剂 LAMP扩增

主要特征

  • 实现核酸的恒温扩增,无需核酸扩增仪,一台水浴锅即可;
  • 高特异性,采用4/6条特异引物识别目的基因上的6/8个区域;
  • 扩增速度快,效率高,可在30-60min内获得结果;
  • 结果判定简单,肉眼即可判断扩增效果。
  • LAMP引物设计

    LAMP引物的设计主要是针对靶基因的六个不同的区域,基于靶基因3' 端的F3c、F2c和Flc区以及5' 端的Bl、B2和B3区等6个不同的位点设计4种或6种引物。
    FIP:上游内部引物,由F2区和F1C区域组成,F2区与靶基因3’端的F2c区域互补,F1C区与靶基因5' 端的Flc区域序列相同。
    F3引物:上游外部引物,由F3区组成,并与靶基因的F3c区域互补。
    BIP引物:下游内部引物,由B1C和B2区域组成,B2区与靶基因3' 端的B2c区域互补,B1C域与靶基因5' 端的Blc区域序列相同.
    B3引物:下游外部引物,由B3区域组成,和靶基因的B3c区域互补。
    1.被扩增的靶序列长度最好不要超过200bp。
    2.内引物的末端最好不要富含AT碱基对,其末端稳定性自由能(△G)值小于-4kcal/mol。
    3.TM 值要求 F1c/B1c=64~65℃; F2/B2=59~61℃;F3/B3=59~61℃;LoopF/LoopB=64~65℃。
    4.GC 含量 尽可能保证引物的 GC 含量在 40~65%。
    5.引物间距F2的5’末端到B2的5’末端约为120~160bp;F2的5’末端到F1c的5’末端约为40~60bp;F3的3’末端到F2的5’末端约为0~60bp;LoopF 位于 F2c的3’末端和 F1c的5’末端之间; LoopB 位于B1的3’末端和B2的5’末端之间;
    6. 引物设计软件:
    在线设计:PrimerExplorer V5:http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html
    本地设计:LAMP Designer 如需设计,可发送email至order@haigene.cn,我们提供免费设计服务。

    LAMP结果判定

    1. 羟基萘酚蓝(HNB)法:
    羟基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂,当溶液中存在Mg2+时,颜色为紫色,而随着反应的进行,由于大量焦磷酸根离子的生成与Mg2+相结合,消耗了溶液中的Mg2+,颜色会由紫色变为天蓝色。

    2. TaqMan探针法:
    应用六条特异性引物和一条TaqMan探针,在具有强链置换能力、高效DNA合成能力、具有外切酶活性的Bst DNA聚合酶的作用下,切割探针后产生荧光信号。

    3. 肉眼观察焦磷酸镁白色沉淀法
    LAMP在反应过程中,由于其反应效率高,速度快等特点,在反应中dNTP会解离出大量的焦磷酸根离子,与溶液中的镁离子相结合生成焦磷酸镁白色沉淀,而焦磷酸镁的生成量和DNA的扩增量呈正比。

    4. 钙黄绿素法
    钙黄素(Calcein)就是一中金属离子络合剂,它需要和荧光淬灭剂Mn2+一起使用,当反应体系中存在这两种物质时,随着阳性反应的进行生成大量的焦磷酸根离子,与钙黄绿素竞争结合Mn2+,从而使Calcein缺少了Mn2+而开始出现荧光,当反应结束后,阳性结果为浅绿色

    5. 琼脂糖电泳法
    LAMP扩增的产物是不同大小的DNA片段,琼脂糖凝胶电泳后,在紫外灯照射下能够观察到大小不等的梯度条带。

    6. 浊度监控法
    LAMP扩增反应, 产生大量的焦磷酸镁白色沉淀,反应液的浊度上升,用浊度仪监测其浊度可反映出LAMP扩增产物的情况,可设阴性对照检测引物的特异性。

    使用方法

    1.典型的DNA LAMP扩增反应,以Bst2.0 DNA聚合酶为例2.典型的RNA LAMP扩增反应,以Bst3.0 DNA聚合酶为例
    反应体系配制
    Bst2.0 DNA Polymerase (8 U/μl)                     0.25~1 μl
    10×Bst Buffer                                                     2.5 μl
    dNTP Mixture (10 mM each)                                3.5 μl
    100 mM MgSO4                                                 1.5 μl
    模板DNA                                                    10 ng~1 μg
    *10xPrimers                                                        2.5 μl
    ddH2O                                                      Up to 25 μl
    *10X Primers:16 µM FIP/BIP, 2 µM F3/B3, 4 µM LoopF/B each。
    反应条件: 65°C 30~60min; 85°C 5min 失活。
    反应体系配制
    Bst3.0 DNA Polymerase (8 U/μl)                     0.25~1 μl
    10×Bst Buffer                                                     2.5 μl
    dNTP Mixture (10 mM each)                                3.5 μl
    100 mM MgSO4                                                 1.5 μl
    模板DNA                                                     1 ng~1 μg
    *10xPrimers                                                        2.5 μl
    ddH2O                                                      Up to 25 μl
    **10X Primers:16 µM FIP/BIP, 2 µM F3/B3, 4 µM LoopF/B each。
    反应条件: 70°C 30~60min; 98°C 15min 失活。