PCR DNA聚合酶类
超保真G5U DNA聚合酶——————超保真扩增的全能选手！
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G5U 超保真DNA 聚合酶，由HaiGene分子酶进化平台（in silico Design & invitro Evolution Workflow）筛选获得。该酶来源于高保真DNA聚合酶，并加入了增强的延伸结构，使其具有长片段扩增、高产能力。强压力筛选的外切活性区域（100xTaq酶保真度），使其具有超保真性能。底物活性中心的改造，使其具有dUTP渗入的能力、扩增含有尿嘧啶模板的能力。使用该酶可轻松扩增8kb的基因组DNA、20kb的λDNA。G5U 超保真DNA 聚合酶具有2kb/min以上的延伸速度。该酶具有强3’-5’的外切酶活性，产物为平末端。 许多有高保真功能的聚合酶来源为 B型 DNA 聚合酶，在遇到 DNA 模板中的尿嘧啶碱基时停止复制。 G5U删除了尿嘧啶结合域，使其能够读取和扩增含有尿嘧啶的模板，该性能赋予其独特的“U” 特征。该特征有两个重要的应用方向：（1）用于超保真扩增重亚硫酸氢盐转化、脱氨基、或受损DNA；（2）在超保真扩增中搭配dUTP和热敏UDG，用于防止PCR体系中携带污染。除此外，也多用于USER 克隆。 |
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主要特征 |
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单位定义 |
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| 一个活力单位即在72°C条件下，30分钟内催化10 nmol dNTP的掺入反应成为酸不溶性物质所需的酶量。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
储存 |
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（1）酶储存液：10mM Tris-HCl，pH7.6，100mM NaCl，0.05% Tween20, 1mM DTT，0.5mM EDTA，50%甘油。 （2）置于-20°C以下，可保存3年。 |
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功能性测试（该数据来自HaiGene实验室，未经允许不得转载！） |
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| 1.不同长度片段的扩增图（最高到20kb） | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| Fig1：使用G5U HiFi DNA Polymerase以gDNA为模板进行扩增500bp-8kb的产物，以λDNA为模板扩增15-20kb的产物。酶的使用浓度为：0.02-0.04U/μl。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2. 扩增dUTP能力测试 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| Fig2：G重硫酸盐处理DNA后，未发生甲基化的C碱基转化为U碱基，使用G5U HiFi DNA Polymerase用于高保真扩增DNA甲基化实验，扩增产物为500bp，酶的工作浓度为0.04U/μl。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 3.不同酶量扩增效果 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| Fig3：以gDNA为模板（2ng/μl）分别使用不同量的G5U扩增5kb的片段，如图所示在0.02U/μl的酶浓度下即可有效扩增。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 4.扩增灵敏度展示 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| Fig4：使用G5U HiFi DNA Polymerase以不同量的gDNA为模板扩增500bp的产物，如图所示该酶可扩增低至10pg的gDNA（约3-5个细胞），酶工作浓度为0.04U/μl。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 5.保真度扩增实验 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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| Fig5：使用含不同保真度的DNA聚合酶的PCR Mix对DNA模板进行扩增35cycles后，进行NGS测序。结果表明：G5U HiFi DNA聚合酶具有最高的保真度，约是taq酶的105倍。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
